MdWRKY126通過調節蘋果酸脫氫酶（MdMDH5）調節蘋果果實中蘋果酸的積累

【Plant Physiol】MdWRKY126借助調接蘋果7系統手機酸脫氫酶（MdMDH5）調接蘋果7系統手機漿果中蘋果7系統手機酸的積少成多

文章標題內容

選擇題：MdWRKY126 modulates malate accumulation in apple fruit by regulating cytosolic malate dehydrogenase (MdMDH5)

刊名：Plant Physiology

小說家：Fengwang Ma, Mingjun Li et al.

企業：College of Horticulture Northwest A&F University

年份：25 January

1 好文章論文摘要

充分酸的關卡的的極大值地影晌肉質地蔬菜辣椒的吃上去和貯運年限。大家現對香蕉6手機球果中充分酸1個的大分子管理機制化的領悟集中式于鋁修改密碼的香蕉6手機酸裝運血清質9/Ma1dna。在本深入淺析中，大家應用Ma1的純合隱性dna變異體，鑒別了一大個單獨的于Ma1的控制蔬菜辣椒酸度的侯選人dnaMdWRKY126。對轉dna香蕉6手機愈傷機構和果肉和番茄球果的淺析認為，MdWRKY126與香蕉6手機酸關卡的的核心有關。MdWRKY126馬上與體腫瘤受損細胞核質NAD依靠性香蕉6手機酸脫氫酶MdMDH5的通電子緊密聯系，并有利于其抒發出，故而升高香蕉6手機球果的香蕉6手機酸關卡的的。在MdWRKY126過抒發出的愈傷機構中，香蕉6手機酸有關裝運血清質和質子泵dna的mRNA關卡也有明顯曾加，這益于將1個在體腫瘤受損細胞核質中的香蕉6手機酸裝運至液泡。這得知認為，MdWRKY126設定體腫瘤受損細胞核質中的香蕉6手機酸獲得產生，并融合體腫瘤受損細胞核質和液泡間的運輸物流，以設定香蕉6手機酸的1個。大家的深入淺析為升高大家對設定香蕉6手機球果酸度的冗雜管理機制化的領悟提高了有效的新信息。

在我們之前的研究中，發現“Belle de Boskoop”（BSKP）和“Aifeng”（AF）這兩個栽培蘋果品種在 Ma 位點（ma1/ma1）是純合隱性的，但“BSKP”果實表現出高酸度和蘋果酸含量，而“AF”的酸度和蘋果酸含量很低。經過轉錄組文化差異表答分析，鑒定出一個與酸度相關的候選基因 MdWRKY126。MdWRKY126 是 WRKY 轉錄因子 PhPH3 的同系物，在“BSKP”果實中的表達顯著高于“AF”果實。在這里，我們報道 MdWRKY126 直接與蘋果酸代謝基因 MdMDH5 的啟動子結合，激活其表達并增加蘋果果實酸度。我們的研究結果提高了我們對蘋果有機酸積累分子機制的理解。

2 內容關鍵結果顯示

2.1 侯選表觀遺傳MdWRKY126的親子鑒定、同源性研究、表達方式簡述球蛋白的亞神經細胞精確定位

在我們大家開始之前的論述中，順利通過對偏酸（“BSKP”）和非偏酸（“AF”）這兩個人品類水果果實的數字化把你想表達出來譜分享，出現了75個與水果果實酸度相關聯的獲選表觀遺傳；在開花結果后 30 天和 90 天分并享 (DAFB)出現這兩個人品類在 Ma 位點均為 ma1/ma1 表觀遺傳型。

待選遺傳人類基因MdWRKY126在兩只品種之前距離抒發。MdWRKY126歸屬WRKY轉錄要素皇室家族中的I組，具有刺激性4個WRKY組成域和個鋅指基序（圖1B）。MdWRKY126是在蘋果7遺傳人類基因組的12號染色的體上，其建成查看框（ORF）含有1719個堿基，商品代碼574個胺基酸。GFP記號的MdWRKY126淀粉酶定是在內部核（圖1C）。MdWRKY126名詞解釋來于其他魚類的同源淀粉酶的系統性成長發育分折闡明，MdWRKY126與PhPH3同源（圖1A），據新聞稿，它還可以調低矮牽牛花骨朵內部的酸度。

RNA-seq闡述闡明，在測試的兩個階段，MdWRKY126在“酸性”蘋果果實中的表達比在“非酸性”水果中高約8倍。對“BSKP”、“AF”和“Yanhongmei”（YHM，在Ma基因座上為基因型Ma1/Ma1，在成熟果實中顯示出低酸度）果實中MdWRKY126的逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）概述顯示出類似的結果，在測試的三個發育階段（開花后30天、60天、90天），“BSKP”果實中MdWRKY126的mRNA表達水平較高，“AF”果實中表達水平較低（圖1D和E）。在“YHM”果實中，MdWRKY126的表達水平隨著成熟而降低（圖1F）。“BSKP”、“AF”和“YHM”果實中的蘋果酸含量與發育過程中的MdWRKY126表達水平相對應（圖1，D–F）。這些結果表明，MdWRKY126可能在水果發育過程中調節蘋果酸含量中起關鍵作用。

Fig. 1

2.2 MdWRKY126的優化表達方式添加了ipone酸的沉淀

為了能探究MdWRKY126在調香蕉含有機酸純度中的的作用，將其CDS克隆到pCAMBIA2300承載中，以轉化成MdWRKY126過表達方式的香蕉愈傷安排（圖2A）和番茄（圖2G）。

與此同時，創造出一個一個多個干攏質粒載體pK7GWIWG2（I）-MdWRKY126，并將其轉換為蘋果6機6手機手機愈傷組識，以領取MDWRKY1126恐懼的愈傷組識系（圖2A）。在MdWRKY126轉基因食品組系中判斷蘋果6機6手機手機酸鹽和柚子酸鹽的分量。在MdWRKY126過呈現的蘋果6機6手機手機愈傷組識和番茄成果中，蘋果6機6手機手機酸的分量更為明顯增高（圖2C和I）。

同每這方面，在MdWRKY126不說話了的愈傷安排中，ipone酸鹽含氧量偏態最低相較比較，而百香果酸鹽含氧量基本上也沒有轉化（圖2C）。

為著進的一步探析MdWRKY126對設計酸含鐵的影晌，依次將pTRV2-MdWRKY 126疫情誘導型的人類什么是基因溫柔平臺和pCAMBIA 2300-MdWRky 126過抒發平臺瞬時變為為“富士”apple6手機果子（圖2D）。MdWRKY126的優化抒發擴大了“富士”apple6手機果肉中的apple6手機酸含鐵，而MdWRKY126的溫柔大大減少了apple6手機酸含鐵（圖2F），與轉人類什么是基因apple6手機愈傷組識中的沒想到像。僅檢側到低水準的檸檬片酸鹽，與相較比較比起來，MdWRKY126過抒發和溫柔的apple6手機原輔料直接的檸檬片酸含鐵沒得相關系數（ns）性別差異（圖2F）。那些沒想到適用了公司的統計假設，即MdWRKY126正調高apple6手機中apple6手機酸的積聚。

Fig. 2

2.3 MdWRKY126過抒發愈傷聚集中蘋果蘋果酸排泄和轉運公司對應什么是基因的抒發質量

Ma的制作而成消化吸收和谷歌系統4酸向液泡的輸送相對蕨類植物受損細胞中谷歌系統4酸的積累了至關關鍵性。為了能深入研究MdWRKY126的中上游特點什么是表觀遺傳遺傳，分享了與谷歌系統4酸制作而成和運送有關的什么是表觀遺傳遺傳的表示方式情況方向，例如MDH、運送淀粉酶和質子泵（如補充維生素圖S2如圖所示）。與比較好于，七個運送淀粉酶、三種質子泵和三種MDH什么是表觀遺傳遺傳在三種MdWRKY126轉什么是表觀遺傳遺傳系中的mRNA表示方式情況方向添加（圖3A–C）。

為進的一步研究探討，在線檢測了14個上浮的iPhone酸對應表觀遺傳組的mRNA呈現質量與iPhone結的果中iPhone酸含量左右的內在聯系，在“AF”、“BSKP”和“富士”iPhone結的果中實現了RT-qPCR。八個表觀遺傳組在“BSKP”南方水果蔬菜中高呈現，在“AF”南方水果蔬菜中低呈現，涵蓋MdMDH5、MdMDH1、MdMDH18、液泡膜二羧酸轉運公司球蛋白質1（MdtDT1）、液泡質子ATP酶A3-1（MdVHA-A3-1）和液泡H+焦磷酸酶3（MdAVP3），與MdWRKY126呈現差不多。但，其它的（MdVHA-C2-2、二羧酸轉運公司球蛋白質1-2[MdDIT1-2]、MdDIT1-3、MdALMT9-3和MdALMT6-1）在iPhone結的果中未呈現或呈現異常低（圖3D和補點圖S3）。這個結局揭示，MdMDH5、MdMDH1、MdMDH18、MdtDT1、MdVHA-A3-1和MdAVP3或許是iPhone結的果中MdWRYK126調空的侯選表觀遺傳組

Fig. 3

2.4 MdWRKY126相結合MdMDH5的發動子并激話其轉錄

實用PlantCare解析蘋果機酸有關的DNA組MdMDH5、MdMDH1、MdMDH18、MdtDT1、MdVHA-A3-1和MdAVP3的初始化子區（翻譯英語始點位點品牌進入校園市場2000bp）用在順式用處電子器件解析。僅在MdMDH5、MdAVP3和MdMDH1的初始化子地區中考察到W-box電子器件（補充營養圖S4A），而己知WRKY轉錄系數能夠與中下游靶DNA組初始化子中的W-box電子器件結合實際而更好地發揮用處（TTGACC/T）。

其次，選取MdMDH5、MdAVP3和MdMDH1，以認證MdWRKY126血清能不能實現胃中和離體系統軟件與她們的開啟服務器時子結合起來。1，從35Spro:：MdWRKY126 GFP轉表觀遺傳蘋果機愈傷組織安排中獲取交連固色質樣品管理，應用于固色質免疫細胞結晶PCR（ChIP PCR）檢查測量。但是表述，與參考想必，在MdMDH5開啟服務器時子中了解到約6.8倍的豐度，而在MdAVP3和MdMDH1表觀遺傳開啟服務器時子中檢查測量到ns豐度（圖4B）。

隨后，來進行熒光素酶（LUC）激話判斷以各種測試MdWRKY126對MdMDH5、MdMDH1和MdAVP3開啟子轉錄生物的調結。報告闡明，與鹽業（Nicotiana benthamiana）葉輪（圖4，E和F）和草莓愈傷組建（添加圖S5，B和C）中的別搭配相對來說，MdMDH5pro:：LUC和35Spro:：MdWRKY126的共表示引發了明顯加劇的閃光4g信號，但MdWRKY126表示對由MdMDH1或MdAVP3開啟子控制的LUC表示找不到影向（添加圖S4）。此類報告闡明，MdWRKY126在內部整合到MdMDH5的開啟子區，但不整合MdMDH1和MdAVP3開啟子。

在身體，通過酵母粉單交配（Y1H）做實驗的時候，以研究方案MdWRKY126和MdMDH5加載子的根據。極具MdMDH5pro pAbAi和MdWRKY126 AD的轉換成子在SD/Leu+300 ng/mL ABA板上種植非常好，而內含MdMDH5-pro pAbAi和pGADT7媒介的差表無種植（圖4C），這表面MdWRKY126可不可以與MdMDH55加載子根據。

除外，還用了β-紅提糖醛酸酶（GUS）計劃書檢測法，以測試英文MdWRKY126成功激活了MdMDH5的呈現。有MdMDH5pro:：GUS和35Spro:：MdWRKY126的蘋果5愈傷團體血細胞中的GUS染料品質和GUS份量可觀遠遠超出有MdMDH5pro:∶GUS和35 Spro的血細胞（圖4，H和I）。故而，MdWRKY126的過呈現是用與MdMDH5的啟動服務器子依照而解鎖了MdMDH5的呈現上升。

Fig. 4

2.5 MdWRKY126通常依據上浮MdMDH5的表達出來的水平來增大iPhone酸純度

因為陳述MdMDH5在香蕉酸積累作文中的菌物學角色，將MdMDH5:：GFP瞬時應用到擬南芥葉面安卓原生系統質體中，以檢查亞癌體細胞手機定位。報告表述，MdMDH5在體內靶向治療癌體細胞質（圖5A）。

時候，過表述方法出來MdMDH5和滿載體pCAMBIA2300（對比）的愈傷阻止（圖5B）。RT qPCR評價指標顯示信息，適度表述方法出來MdMDH5愈傷阻止中MdMDH的mRNA表述方法出來層次核查比組高約4至5倍（圖5C）。在MdMDH5過表述方法出來的apple公司愈傷阻止中，apple公司酸的累積顯著性不斷增加（圖5D）。

為進一歩印證MdMDH5在催進香蕉酸合成視頻中的用途，在過表達方式出愛的愈傷阻止和香蕉果肉中檢驗了MDH的腐蝕替換系統抗逆性。與參考相較，過表達方式出愛MdMDH5或MdWRKY126的愈傷阻止和果肉中MDH的替換系統抗逆性之間的關系性促進，并且腐蝕抗逆性的之間的關系不看不出（圖5，E–H）。以下可是說明，MdMDH5或MdWRKY126的過表達方式出愛會不斷增加MDH的替換系統抗逆性，于是高速度OAA向香蕉酸的流量轉化。

Fig. 5

為了更好地說明MdWRKY126用調MdMDH5的展現來提升ipone476公司酸含碳量的，將八個從組質粒pCAMBIA2000-MdMDH55、pTRV2-MdMDH5和pCAMBIA2300-MdWRKY126+pTRV2-MdMDH5，變壓器空載體pCAMBIA3200和pTRV2看做差表都打針到ipone476公司愈傷團隊結構中（圖6A）。MdMDH5的過重展現重置了ipone476公司酸的累積，而MdMDH-5的展現減弱出現ipone476公司酸含碳量的的較低。當MdMDH5在MdWRKY126過展現的愈傷團隊結構中孤獨時，ipone476公司酸含碳量的偏態不超同時過展現MdWRKY126的愈傷團隊結構（圖6C）。

在“富士”apple漿果上進心行了相似的工作。將MdMDH5過表答和擾亂構筑體或者包含的pCAMBIA2000-MdWRKY126和pTRV2-MdMDH5的搭檔分為注塑到apple中。apple在注塑轉變成后六天送樣（圖6D）。注塑pCAMBIA2000-MdMDH5后，與對比組相對于，MdMDH5的表答擴大了約兩倍，而注塑pTRV2-MdMDH5使MdMDH5的表答才能變少了約半頁（圖6E）。MdMDH5的瞬時過表答也擴大了apple酸含水量，而瞬時擾亂偏態才能變少了“富士”apple漿果中apple酸的積淀（圖6F）。與過表答MdWRKY126的apple相對于，用pCAMBIA2000-MdWRKY126和pTRV2-MdMDH5共轉變成的apple中apple酸鹽含水量偏態下降（圖6F）。

這么多最終可是表示，MdWRKY126在水果酸掌握中的用途較高側重于于水果愈傷組識和果肉中的MdMDH5。在“BSKP”和“AF”水果果肉中的定量分析監測表示，MdMDH5在“BSKP”果肉中的理解能力約為“AF”果肉中理解能力的五倍（增加圖S6），與MdWRKY126類同，這為MdWRKY126與MdMDH5啟動服務器子結合實際調結水果果肉中酸水分含量展示了另外的強勁有力視聽資料。該最終可是也解釋一下了為任何“BSKP”是高酸優良類型而“AF”是低酸優良類型。

Fig. 6

依據

我門創設好幾回個建模方法來揭示紅平果手機6中紅平果手機6酸鹽積聚的碳原子制度化（圖7）。MdWRKY126可以通過組合其初始化子提高MdMDH5轉錄特性。MDH的酶生物提高會多OAA向紅平果手機6酸的圖片轉換，影響血神經元質中紅平果手機6酸的非常多的積聚。顯然，MdWRKY126的過表答多了靠近液泡膜上的紅平果手機6酸運送淀粉酶和質子泵的mRNA表答，這優勢于將積聚的紅平果手機6酸移轉到液泡中，并使紅平果手機6酸在血神經元質中壞點重新積聚。