【Plant Physiol】蘋果MdHT1.2基因介導根際葡萄糖攝取，從而調節植物碳水化合物的分配

【Plant Physiol】蘋果6MdHT1.2染色體介導根際紅提糖攝入，為了控制沉水植物碳水類化合物的左右

提題：Uptake of glucose from the rhizosphere, mediated by apple MdHT1.2, regulates carbohydrate allocation

刊名：Plant Physiology

創作者：Fengwang Ma, Mingjun Li et al.

企業單位：Northwest A&F University, Yangling

準確時間：15 April 2023

01

英文論文

常綠植物根上能夠 從根際代謝碳水化合物，最終得以少光合做用產生了的碳的消耗掉。既使，朋友對根用以調節土壤結構中碳水化合物代謝的內在邏輯知之甚微。在這一里，我認定新一種蘋果機 ( Malus × domestica Borkh.) 己糖運輸核蛋白 MdHT1.2，它在根表面層上表現做用，從根際代謝巨峰葡萄糖水 (Glc)。

立于 RNA-seq 資料，MdHT1.2在蘋果公司根莖的29 個MdHTDNA中反映出層次最大。什么是生化數據分析反映出，MdHT1.2通常在細根的仁衣組織中反映出，其蛋白酶處在質膜上。

轉人類基因iPhone6和番茄的根當用 [ 13 C]-圖標的 Glc 或 2-NBDG 供奉時，過展示MdHT1.2的品系降解 Glc 的能力素質上升，而在iPhone6中緘默MdHT1.2表現對立的但是。

進三步的探討揭示，MdHT1.2 介導的根際 Glc 降解優化了紅蘋果地上方和莖部相互的碳同化物調整，以此上下調整沉水植物滋生。還有就是，番茄融合實踐聲明，加入過表達出MdHT1.2的莖部的 Glc 降解力可能促使碳水無機化合物調整到根莖中。

總的一般來說，大家的實驗認為，MdHT1.2 在根表上展現幫助以釋放根際 Glc，得以調整綠植生張和成果含糖量積累了的碳水無機化合物配資。

02

技術應用途徑

Gala’ apple (Malus × domestica Borkh.) Plant transformation

Subcellular localization assay\RNA-Seq, RT-PCR and RT-qPCR Analysis\Protein detection and western blot analysis

Histochemical localization and in situ hybridization

Sugar feeding assays

Yeast functional complementation experiment

13C pulse labelling assay

Sugar concentration measurements\Determination of plant growth

Measurement of photosynthetic and ratetotal organic carbon (TOC) content

03

關鍵結果顯示 

3.1 MdHT1.2是紅蘋果根中單糖吸收的作用的待選運送蛋白酶

是為了親子鑒定參于草莓5根中單糖代謝的全部的的HTs，讓我國便用RNA-seq數值測定方法了根阻止中29個預估HT基因遺傳的mRNA水準。在一些MdHTs中，讓我國顯示MdHT1.2在根中具有著比較高的轉錄水準（圖1A）。便用大逆轉錄參考值PCR（RT-qPCR）對從草莓5根、莖、葉、成果和莖尖生成的RNA確定MdHT1.2的較為表答了解，否認MdHT120在根中角度表答（圖1B）。

根部的定義決定性了其內分泌系統能力。為此，我們的都檢查測量了MdHT1.2在蘋果機主根、側根和細根中的mRNA描述情況。數據信息展示，MdHT1.2在細根中的描述情況如果超過相關根（圖1C）。因此，與比對相對來說，Glc解決后MdHT1.2 mRNA的描述上浮至5.6倍。我們的都推算MdHT1.2從細根根際吸納單糖的得票數運送蛋清。

圖1。蘋果根中己糖轉運蛋白的篩選及MdHT1.2的亞細胞定位。（A） 基于RNA-seq數據的蘋果根中29個己糖轉運蛋白（HT）基因的FPKM值。（B） 采用RT-qPCR測試MdHT1.2在ipone機阻止（莖、莖尖、葉、果食和根）中的對于比較形容出。將MdHT1.2在莖中的形容出標準設置成為1.0。（C） 應用RT-qPCR檢測工具ipone機主根、側根和細根中MdHT1.2的對于比較形容出。（D） 本氏鹽業葉輪中MdHT1.2-GFP血清的亞人體內部固定。（E） ipone機（Malus domestica Borkh.）根中MdHT1.2-GFP凝固血清的亞人體內部固定。

3.2 MdHT1.2產品定位于質膜，首要把你想表達出來于細根皮層

與基本上數糖裝運蛋清高度，預測的MdHT1.2蛋清跨膜設計域由15個跨膜設計區定性分析。為了能讓確認MdHT1.2蛋清的亞血細胞市場定位，我們都在本氏煙草行業葉輪葉片中瞬時表達出了35S:MdHT1.2-GFP要融合蛋清。它了解清楚地表述，MdHT1.2-GFP的翠綠色熒光數據信號屬于質膜上（圖1D）。

要注意到MdHT1.2在根中的高反映出，將35S:MdHT1.2-GFP整頓質粒生成到根癌農桿菌（K599）中，以高速 誘發ipone（Malus×domestica Borkh.）根的降解。同一，檢查到MdHT1.2–GFP的清晰可見精彩紛呈熒光信息，與圖標質膜的FM4-64的黃色熒光重合（圖1E）。質膜上MdHT1.2–GFP融為一體球蛋白的最最主要的熒光反映出，MdHT1.2或許在質膜糖轉運中樹立的功效。要有效地正確理解MdHT1.2的身理功用，.我來確定了在反映出由MdHT1.2-開機啟動子動力的GUS的轉表觀遺傳擬南芥樹木中的安排和組織反映出特異形（pMdHT1.2%–GUS）。在十天大的轉表觀遺傳擬南芥幼芽中（圖2A），GUS染色的最最主要的在細根和根毛的仁衣（ep）組織中測量到（圖2B-F）。

咱們進幾步實現了原位有性雜交種，以測試ipone細根中MdHT1.2癌血腫瘤細胞的特男人。不錯重視的是，在ipone根尖成熟穩重區的橫載面中，在皮層（ep）癌血腫瘤細胞中測試到MdHT1.2 mRNA的強數據數據（圖2G），這與GUS印染結果顯示不同。在與感測探頭有性雜交種的切成片上未測試到數據數據（圖2H）。雖然，MdHT1.2在根中的癌血腫瘤細胞特男人產品定位顯示其或許在根際糖消除中發揮出反應。

圖2 MdHT1.2的團體化和上皮體細胞活性聊天表達方法模試。（A） 在MdHT1.2pro:GUS擬南芥苗芽和收錄細根（B）、根尖（C）合熟根（D）在其中的根團體化中檢側到GUS復染。（E） GUS復染后的根尖橫受力，甚至進一次的藏紅復染（F）。（G） 用MdHT1.2反義測試電極原位雜交種育種研究蘋果系統手機根尖熟區橫受力中MdHT1.2mRNA的上皮體細胞活性聊天定位系統。屏幕上顯示了亮場形象。（H） 用MdHT1.2感測測試電極雜交種育種的蘋果系統手機根的橫受力身為弱陽性剖析。

3.3 MdHT1.2對酒曲中的Glc體現了轉運公司功效

成了詳情MdHT1.2打碼蛋清的轉運特征參數，人們將MdHT1.2-ORF克隆到平臺pDR196中，并將其被轉化為己糖轉運一些缺陷酒曲菌株EYB.VW4000。這一基因突變酒曲在具有己糖的培育基上如果沒有的的滋生或的的滋生遲緩，但在二糖桃子君糖上的的滋生（圖3）。

我國還將pDR196-MdHT1.2的載體轉換到Suc運輸淀粉酶不足發酵粉變動體SUSY7中，以測試MdHT1.2對Suc的運輸實力。這些變動發酵粉衍生在單糖上，舉個例子Glc（圖3）。MdHT1.2獲取了EYB.VW4000或SUSY7的衍生不足，在帶有1mm-100mM Glc的養成基上面有明顯的菌落，在10mM Glc養成基上衍生更快。

前者，在所含Gal、Fru和Suc的培養基上也監測到中度產生，但用空pDR196媒體應用的鮮酵母基因變異體在上述所說糖培養基上不會復原產生技能（圖3）。這一些然而闡明，與各種糖相對，MdHT1.2對蛋白質展示出密切的底物特情人，并對Glc展示出更好的轉化技能。

圖3。異源傳達MdHT1.2后，己糖攝入量欠佳的酒曲菌菌株EYB.VW4000和Suc攝入量欠佳的酒曲菌菌菌株SUSY7中的滋生互補性。傳達MdHT1.2的EYB.VW4000酒曲菌轉成體區別在填補有1mM、10mM或100mM Glc（草莓糖）、Fru（乳糖）或Gal（半乳糖）的塑造訓練基的配制上塑造訓練；將傳達MdHT1.2的SUSY7酒曲菌轉成體在填補有1mM、10mM或100mM Suc（乳糖）的塑造訓練基的配制上塑造訓練。輕載體（pDR196）和突變性酒曲菌對于照表。

3.4 MdHT1.2助于根際Glc的代謝，其在萍果中的把你想表達出來提升了糖水分含量

只為確立MdHT1.2有沒有有著從根際向根際運輸車Glc的學習能力，你們先在校園營銷推廣活動的環節之中所構建了由35S開機子驅動下載的MdHT120過表述和RNAi形式，第二步生成轉表觀遺傳香蕉公司作物。經歷PCR、RT-qPCR和核營養物質印刷痕跡需求，你們得到了幾個過表述（OE1和OE2）和幾個孤獨（R1和R2）的香蕉公司系，用作那么的研究（圖4A）。

D-Glc的熒光衍化物2-NBDG（2-（N-（7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑-4-基）氨基）-2-脫氧萄葡糖）不被蕨類植物細胞代謝，快速可用于的檢測Glc的攝入和掌握。要想監測器MdHT1.2在根中運輸物流Glc的學習性能，大家第一應用2-NBDG來飼養MdHT1.2-OE和WT根（沉默不語系沒有用嗎2-NBDG飼養，而是我們表述GFP熒光蛋白質）（圖4B）。在與200μM 2-NBDG孵育5一小時后，MdHT1.2-OEapple根的表現出比WT更強的熒光強度（圖4B，C），表述MdHT1.2的過表述可能造成的根中Glc的吸附學習性能有明顯增強。

以便可確認這樣報告單，轉基因植物遺傳蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果根也與[13C]-箭頭的Glc一同孵育。MdHT1.2-OE根中的13C有機廢氣濃度值一直優于WT，但MdHT1.27-RNAi根中的有機廢氣濃度值高于WT（圖4D）。這進這一步大力支持了MdHT1.2在根中Glc吸取中的用途。最后，與野山植物穿山甲型相應比，MdHT1.2-OE根具體表現出更為重要的糖水準，Glc有機廢氣濃度值比野山植物穿山甲型多了約30%。相應比以下，不說話了蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果根中的Glc有機廢氣濃度值比野山植物穿山甲型低12%（圖4E）。使人驚艷的是，伴伴隨Glc貨物運輸的增多，在過表示MdHT1.2的蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果蘋果根中，Fru、Suc和Sor（山梨醇）也多，而在MdHT1.2-RNAi系中，相應于野山植物穿山甲型中的水準，Fru，Suc和Sor分開 縮減了約8%、約20%和約50%。

圖4。MdHT1.2助于香蕉7香蕉76根際對Glc的釋放。（A） MdHT1.2過表示（OE1和OE2）和沉默無言（R1和R2）的香蕉7香蕉76系在提子糖含氧量為4.4g.kg-1DW的環境中生長的。（B） 在與200μM 2-NBDG孵育5天后，2-NBDG在MdHT1.2過表示轉人類遺傳dna系（OE1和OE2）的細根和野山型草本花卉中的積累更多。數量尺，100μM。（C） 2-NBDG在OE和WT香蕉7香蕉76根中的比較熒光。（D） 將草本花卉在繼續補充有[13C]-Glc的Hoagland膳食纖維液中孵育，并在孵育10天后量測轉人類遺傳dna和野山型香蕉7香蕉76根內加射性13Glc的量。（E） 轉人類遺傳dna和野山型草本花卉根中的提子糖（Glc）、單糖（Fru）、白砂糖（Suc）和山梨醇（Sor）質量濃度。（F） 變為和野山型香蕉7香蕉76樹葉的光合頻率。

3.5 MdHT1.2介導的根際Glc消除可影響同化糖的碳分配權，調控蘋果手機莖葉植物的生長

要想進一次熟知MdHT1.2介導的根際Glc運送是不是干擾草木發育期，我們都第一方面檢測工具了轉基因仿真作物遺傳香蕉草木的發育期表型（將香蕉草木移栽到Glc含水量為4.4 g.kg-1 DW的土囊中）（圖4A）。與WT差距，OE香蕉品系的株高、主根寬度和根鮮重有效曾加，而R1和R2品系的這一些的指標進而上升（圖4A，S5）。

除此以外，與WT相對于，MdHT1.2-OEapple的總是有機碳含量的（TOC）在根和地上半部都為之增大，但在遺忘系中為之削減（圖S5D）。就算在MdHT1.2-OEapple根系中生物工程量積淀增大，在遺忘系中削減，但與原生態型相對于，轉基因食品組apple系的光合帶寬不轉化（圖4F）。這認為，MdHT1.2介導的Glc揮發以1種不有變葉面光合實力的玩法干擾apple植被的成長。

為了能進三步探究常綠植物發育與MdHT1.2介導的根際Glc消化吸收之前的聯系，將蘋果系統主莖（轉基因食品組和原生態型）在含或不含0.5%Glc的霍格蘭水溶液中水培15天。結果表明，與野生型相比，Glc喂養顯著促進了MdHT1.2-OE植物的生長，這是通過增加植物高度和根系生長來實現的，但由于Glc吸收減少，這種增強在MdHT1.2-RNAi植物中沒有發生（圖5A，B）。與沒有Glc的對照相比，Glc對根的喂養增加了MdHT1.2-OE植物的生長速率，但降低了MdHT1.2-RNAi植物的生長速度（圖5C，D）。這些結果表明，MdHT1.2介導的Glc在根中的吸收對蘋果植株的生長有正向調節作用。

哪怕Glc馴養后OE系的生態學量同質性增強，但與WT想必，干重根冠比同質性消減（圖5E）。于是，你們預測未來MdHT1.2介導的Glc降解的作用或者會的影響C從地上側到跟部的分發。要為核驗合適預測未來，進行了13C電脈沖記號。將apple葉尖與產于Na13CO3的13CO2一齊孵育，最后化學發光法同化的13C的量，并算出芽和根中的13C分發率。數值彰顯，MdHT1.2-OEapple根中的13C布局范圍率比也是型低約14%，并在沉默不語系中發覺根中13C的相對的聚集度高達（圖5F）。合適地，與WT想必，OE系在地上側的13C聚集度增強了14%。換句話說，這類數值表示，MdHT1.2介導的根際Glc降解的作用可增進樹種滋生并改動碳水無機化合物的布局范圍。

圖5。MdHT1.2介導的根際Glc吸納能能改善同化糖的碳安排原則，并調接谷歌6手機谷歌6手機樹木的生張。（A） WT、MdHT1.2過表現（MdHT1.2-OE）和沉默無言（MdHT1.2-RNAi）谷歌6手機谷歌6手機樹木的生張表型，在有或不有0.5%紅提糖（Glc）的粘液培養基中生張15d。正比尺，6cm。（B）精確測量根生張目標的用戶，包擴根表明積、根重量、頂尖和直徑；（C） Glc加工處理下MdHT1.2-OE、-RNAi和WT谷歌6手機谷歌6手機植被體的株高和（D）對生張數率單位（鮮重）。（E） 根：莖干重比。（F） 在Glc條件下對WT、MdHT1.2-OE和MdHT1.2-RNAi谷歌6手機谷歌6手機植被體通過了13C激光脈沖標識。在根和地上方計算13C安排原則數率單位（13C安排原則率包含4個器臟的13C含鐵與樹木對13C的凈吸納量的比例）。

3.6 異源理解MdHT1.2曾加番茄根際Glc代謝，提高網站動植物植物的生長和糖積累作文

關鍵在于加強組織領導驟否認MdHT1.2在根際Glc降解中的功能和對常綠植物產生了的積極態度導致，產生了了以下三個異源過形容MdHT12的番茄品系（L12、L17和L21）。在轉人類基因番茄系中觀察分析到與水果相似性的成果。2-NBDG市場均衡試驗檢測說明，番茄中MdHT1.2的過形容增大了根中Glc的裝卸搬運（圖S7A，B）。

或許，轉人類表觀遺傳番茄根的糖份量、總會有機碳份量和主根時間加大（圖S7C、D、S8A、B），干重根冠比較低（圖S8C）。自己還用細沙中的番茄對其進行了Glc供應實驗設計，以測試MdHT1.2介導的Glc吸附率與常綠綠植的綠植的的衍生兩者當中的關心。在對比必要情況下，轉人類表觀遺傳和純天然綠植的型番茄根系兩者當中的動物量積攢不會探究到相關性性別差異。與對比相較，在+Glc必要情況下，轉人類表觀遺傳和純天然綠植的型番茄根系的地上側和尖部鮮重加大，但轉人類表觀遺傳番茄根系比純天然綠植的型根系有非常多的動物量積攢，根和地上側鮮重更重，表示MdHT1.2介導的Glc吸附率正調結常綠綠植的綠植的的衍生。或許，在+Glc處里下，轉人類表觀遺傳番茄根系的根冠比急聚下調，這表示碳水有機化合物分配比例將會出現變化無常（圖S9D）。

考慮到進步驟要了解MdHT1.2在結的果中糖上下調整中的能力，我國撤底研究探討了MdHT1.2-過體現番茄結的果（L17和L21），正因為轉dna水稻遺傳蘋果蘋果結的果必須 多年以來的日子。我國在內含4.4 g.kg-1 DW-Glc的森林土壤中種植水果轉dna水稻遺傳和野山型番茄，轉dna水稻遺傳番茄的成熟完善結的果出現出取得加大的結的果容量和可無水磷酸氫固形物水分含量（SSC）（圖6A-C）。除此以外，轉dna水稻遺傳番茄結的果在十個時候[幼期（提升后7天，DAB）、彭大期（17DAB）、破損期（30DAB）揉成熟完善期（45DAB）]成績出快速遠遠超出野山型結的果的Glc、Fru、Suc和Gal有機廢氣濃度（圖6D），發現MdHT1.2的異源過體現能夠更好地上下調整番茄結的果中的糖積累了。

圖6。MdHT1.2在番茄中異源表明加劇了根際對Glc的吸收的作用，提高網站了莢果健康成長期間中的糖積淀。（A） WT和MdHT1.2-OE番茄莢果。的比例尺，1cm。（B）WT和MdHT1.2-OE番茄（L17和L21）莢果的莢果承重和（C）可無水磷酸氫固形物量（SSC，%）。（D） 兩個健康成長過程的可無水磷酸氫糖鹽濃度測得：7 DAB（發苗后天性數）（幼果）、17 DAB（開裂期）、30 DAB（破碎機期）和45 DAB（比較成熟果）。

3.7 在稼接檢測中，番茄中的MdHT1.2就能夠驅動碳水有機化合物向果實的分銷

根據出現會發現發現，根際Glc鍵入的增大會會反應碳分銷（圖5F），小編預測異源表現MdHT1.2的番茄果實糖含氧量的的增大也會是由同化碳在果實中的布局增大促使的。想要印證某些假如，WT和轉人類基因番茄系L17相護看做接穗和砧木開始枝接苗科學試驗。建設了五個枝接苗組和（接穗/砧木）：WT/WT、L17/WT、WT/L17、L17/L17，其在有或未Glc的砂石上的發展（圖7）。但是發現，外源Glc加工處理利于了番茄果實的彭大，灌根Glc后，果實質量和可可溶性固形物含氧量的（SSC%）均正相關增大（圖7A-C）。有趣的數學的是，當L17在+Glc水平下看做砧木時，這個對果實的發展的利于更特別。于此，當MdHT1.2在番茄根中表現時，成熟穩重果實中的Fru、Glc和Suc也正相關增大（WT/L17和L17/L17），而較中枝接苗番茄當中未不同（圖7D-F）。糖含氧量的的增大并不反應光合用處（圖7G）。13C脈沖造成的標上顯現，未Glc的的發展會發生變化枝接苗番茄動值物的碳分銷，但根來自于L17（MdHT1.2-OE）的動值物的的發展的確增大了C向果實的分銷速度（圖7H）。這發現MdHT1.2介導的根際Glc消除可能發生變化同化C在果實中的布局，并上下調整果實中的糖積攢

圖7。在枝接工作中，用異源描述MdHT1.2增高番茄根際對Glc的消化，還可以促進會碳水單質向樹種子的分銷。（A） WT/WT、L17/WT、WT/L17、L17/L17（接穗/砧木）的枝接樂隊搭配組合在內含（＋Glc）或不內含（參考）Glc的沙土上生長的后，在45DAB中的表型（出筍后三天）。（B） 在有或沒有Glc操作下，枝接樂隊搭配組合WT/WT、L17/WT、WT/L17、L17/L17的比較成熟樹種子中的樹種子凈重和（C）可無水磷酸氫固形物水平（SSC%）。（D-F）轉人類基因和純天然型番茄樹種子中的匍萄糖（Glc）、低聚果糖（Fru）和乳糖（Suc）濃度值（45DAB）。（G） 枝接番茄在填加或不填加Glc操作下的光合速率單位。（H） 在＋Glc和參考必備條件下對枝接樹木開展13C脈寬標志耐壓試驗，然后呢求算標志的13C在根、莖（葉+枝）和樹種子中的分銷率（13C分銷率各指4個器管的13C水平與樹木對13C的凈消化量的占比）。

04

報告

我的設計呈現，MdHT1.2是一個種蘋果7己糖運輸核蛋白，在根表皮層上充分調動能力，從根際代謝Glc，促進會根的萌發，這減輕了從地頂部到尖部的同化碳合理安排（源葉碳供應商-匯根碳供需），造成同化碳向另一庫（要是實）的合理安排曾加。在異源描述MdHT1.2的番茄中，MdHT1.2-介導的Glc在尖部的代謝需要變動碳合理安排，并結果英文曾加果食動物量。

考量到萍果樹生長的期長，番茄枝接試驗報告進這一步檢驗了這一碳安排。換句話說，MdHT1.2介導的根Glc吸收的作用可能轉換源庫碳水無機化合物的安排，并從而可以淡化仿真植物成長和果實糖的積淀（圖8）。

某項研究探討添充了己糖裝運核蛋白在介導根際糖獲得和設定源庫同化碳分布不均方向的效果空白一片，MdHT1.2-OE苔蘚植物可能當上內在的的的品質良好砧木，可以選擇于增加碳源有機物的靈活運用工作效率和結的果的品質

圖8。MdHT1.2在根際Glc汲取和作物發展期和果子糖掌握的碳水有機化合物分發的調節中的做用整治。MdHT1.2是一種種蘋果7系統己糖裝運蛋白質，促使Glc從根際汲取到根上，這就能夠推動根莖發展期，少從地上方到根上的同化碳分發（源-葉-碳產生-匯-根-碳訴求），引致同化碳分發提升到任何儲庫，這樣子。要注意蘋果7系統樹的長發展期壽命，可以通過適用異源表現MdHT1.2的番茄實現稼接進行實驗，核實了MdHT1.2-介導的根莖紅提糖汲取與果子安全性能間的干系。