【老中醫草藥與免疫檢測】丹皮酚對 β-1,3-葡聚糖引導的小鼠巨噬細胞核 Dectin-1 / NLRP3 表現 環路限生產制用處探索

一 論文產品信息

小題目：丹皮酚對 β-1,3-葡聚糖引導的小鼠巨噬受損細胞 Dectin-1 / NLRP3 手機信號 徑路控加工用分析

刊名：中醫師西藥與免疫性

創作者：吳嘉迪 段強軍 肖 楠等

組織：江蘇中醫師藥學校

準確時間：. 2020. 04

01提要

重要性:理論研究丹皮酚對 β-1,3-葡聚糖引導的巨噬細胞核上 Dectin-1 / NLRP3 警報徑路的導致。

步驟:訓練小鼠 RAW264. 7 巨噬腫瘤上皮癌生殖上皮細胞,并切割成空白一片對照組、β-1,3-葡聚糖介導繪圖組、昆布多糖組和丹皮酚組,β-1,3-葡聚糖介導巨噬腫瘤上皮癌生殖上皮細胞 24 h 組建 ALD 細菌感染繪圖。 確認 MTT 法測量腫瘤上皮癌生殖上皮細胞滲透性,確認反過來高倍顯微鏡觀擦各組形式學的變化,確認 Western blot 測量小鼠 RAW264. 7 巨噬腫瘤上皮癌生殖上皮細胞 Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白質的體現,確認 RT-qPCR 測量小鼠 RAW264. 7 巨噬 腫瘤上皮癌生殖上皮細胞 Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA 的體現,確認 ELISA 測量各組訓練液中 IL-1β、IL-18 的分沁質量。

后果:MTT 后果表 明,與留白比組對比,β-1,3-葡聚糖幫助模式化組減緩神經元核系分裂繁殖抗逆性減退。 與 β-1,3-葡聚糖幫助模式化組對比,丹皮酚指導后細 胞分裂繁殖抗逆性增加。 結構特征學觀擦發覺,留白比組神經元核系球輕巧,結構特征圓翹。 β-1,3-葡聚糖幫助后神經元核系球體積大小增大了,多樣性嚴重性,結構特征 細長。 丹皮酚指導后神經元核系多樣性避免,神經元核系結構特征矩陣合同扇形。 Western blot、RT-qPCR 和 ELISA 后果取決于,與留白比組對比,β-1, 3-葡聚糖能有效偏高巨噬神經元核系中 Dectin-1、 Syk、NLRP3、ASC、 pro-caspase-1、 caspase-1 的蛋清呈現平均關卡和 Dectin-1、NLRP3、 caspase-1 mRNA 呈現平均關卡及及神經元核系上清液 IL-1β、IL-18 的分沁平均關卡。 而與 β-1,3-葡聚糖幫助模式化組對比,經丹皮酚指導后可 明顯的減少巨噬神經元核系中 Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 的蛋清呈現平均關卡和 Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA

展示方法橫向甚至受損細胞上清液 IL-1β、IL-18 的分泌量橫向。 最后:本科研最后反映丹皮酚應該按照阻止 β-1,3-葡聚糖促進的 Dectin1 / NLRP3 數據信號徑路上 Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 的過展示方法借以很好調低終末宮頸真菌感染系數 IL-1β 及 IL-18 的揮發,借以很好阻止 β-1,3-葡聚糖促進的 ALD 宮頸真菌感染作用。

02核心詞：

丹皮酚;β-1,3-葡聚糖;巨噬細胞核;Dectin-1 / NLRP3 移動信號徑路

03 建材的方式

3.1涂料

丹皮酚購自宣地市 百草蕨類植物工貿有限總部英文總部(溶解度>99% );β-1,3-D-葡 聚糖、昆布多糖購自荷蘭 Sigma 機構;胎牛血清購自 昆明 HAKATA 公司的;DMEM 高糖養育基購自英國 HyClone 集團公司;青霉素-鏈霉素懸濁液購自合肥碧云天 有限公司;Trizol 實驗試劑購自法國 ambion 機構; 反轉錄試 劑盒、SYBR 熒光染色劑購自島國東洋紡新公司;抗小鼠 β-actin 表面抗原購自蘇州中杉金橋微生物技木受限品牌;

抗小鼠 Dectin-1 抗體陽性購自美國的 Santa Cruz 新公司;抗 小鼠 caspase-1 抗體陽性、抗小鼠 NLRP3 免疫抗體和辣根過 脫色物酶標示二抗均購自新西蘭 Affinity 機構;抗小鼠ASC 抗體陽性和抗小鼠 Syk 表面抗原均購自營口萬類動物科 技有限子公司子公司;ECL 亮光液購自芬蘭 Advansta 大公司; PCR 引物選擇 Primer 5. 0 結構設計,并由生工海洋生物市政工程(南京)控股股東有限大公司英文大公司分解成;小鼠 IL-1β、IL-18 ELISA制劑均購自泉州市睿信生物工程科學有限責任集團。

3.2  方式

3.2.1  RAW264. 7 巨噬細胞的培養及藥劑調查 將 凍具備-80℃ 冰柜的 RAW264. 7 巨噬細胞系恢復后, 參與含 10% 的胎牛血清、100 U/ ml 青、鏈霉素的 DMEM 養育基中在 37℃ 、5% CO2 陪養計劃箱中陪養計劃 24 h,每晚開展觀看神經細胞繁殖情況下,定期進行根換致力于 基,當組織細胞符合對數計算種子發芽期、整合度到 80% 綜上所述時,將神經元實行分成小組,即空白頁對照組、β-1,3-D-葡聚糖誘 導對模型組、昆布多糖組、丹皮酚預防組。 依照想關文 獻各類早期型號和藥材建立結杲[15-17] ,我國選則70 μg / ml β-1,3-D-葡聚糖造宮頸炎癥仿真模型,250 μg / ml 最為昆布多糖的用藥量,480 μmol / L 當做丹皮酚服用量。 空白頁參考組和 β-1,3-D-葡聚糖引發對模型組用 DMEM可以養成基對細胞膜完成養成 24 h,昆布多糖組用昆 布多糖(250 μg / ml) 對內部開始診治 24 h,丹皮酚 診治組用丹皮酚 ( 480 μmol / L) 對體細胞對其進行調控24 h,后來棄掉有效的培植基,除空頁差表組進入新 鮮含血清的 DMEM 培訓基已經培訓 24 h 外,剩余組 下載 70 μg / ml β-1,3-D-葡聚糖引誘 24 h,后來對四 組的培育液與內部采取收集整理。

3.2.2  MTT 法論文檢測巨噬神經元的增值能力親水性 預防接種 3× 10 5 ml -1 RAW264. 7 巨噬細胞膜于 96 孔板,待 24 h 完 全貼壁后,棄上清,加 PBS 清理 3 遍,空缺比對組和β-1,3-D-葡聚糖引誘整治組倒入鮮美 DMEM 培養出來 基,丹皮酚指導組假如丹皮酚(480 μmol / L),昆布 多糖組加進昆布多糖(250 μg / ml),分辨鍛煉 24 h后,棄掉合適的的細胞培養液,除亂碼對應組倒入新鮮感含血 清的 DMEM 訓練基再訓練 24 h 外,其中組申請加入 70 μg / ml β-1,3-D-葡聚糖促進 24 h 后,陰涼建立5 mg / ml MTT 上班液 20 μl,裝入二被氧化碳致力于箱避 光培植 2 h 后,棄上清,放入 200 μl DMSO 對處變不驚在 孔板底端的深棕色甲臜沉墊對其進行析出,制冷平放搖床 低速行駛自由振蕩 10 min,酶標儀通過比色,法測定 490 nm 波 長下吸光度值。

3.2.3反置體視顯微鏡仔細觀察細胞形態特征 預防接種 3×10 5 個/ ml RAW264. 7 巨噬受損細胞于 6 孔板,待 24 h 充分貼壁 后,棄上清,加 PBS 的清洗 3 遍,空白處對應組和 β-1,3- D-葡聚糖誘騙模特組用 DMEM 培養出基對上皮細胞做 孵育 24 h,Dectin-1 克注射劑昆布多糖組用昆布多糖 (250 μg / ml)對人體細胞做好孵育 24 h,丹皮酚介入組 用丹皮酚(480 μmol / L)對癌細胞使用孵育 24 h,往后 棄掉相同的培養出基,除亂碼對應組建立新鮮毛肚含血清 的 DMEM 激發出來基接著激發出來 24 h 外,另外組融入70 μg / ml β-1,3-D-葡聚糖促進 24 h,往后棄上清,用 PBS 潔凈 3 遍后,下載明確 PBS,用反置高倍顯微鏡觀察分析 各組內部形狀變遷。

3.2.4 雷達回波圖熒光降鈣素原檢測 PCR 對巨噬受損細胞 Dectin-1、 NLRP3、caspase-1 mRNA 表達愛的查測 將處置過的 受損細胞用開始預冷的無茵 PBS 洗掉 3 次后,用腫瘤細胞刮 刀將上皮細胞刮了并持續到無酶 EP 分液漏斗,給出 RNA 截取化學試劑盒的部驟來 RNA 領取。 時候據瓦解 錄制劑盒的關鍵步驟采取換向錄成 cDNA。 任何引物通過 Primer Premier 5. 0 系統設定,授權委托書佛山生工生物學 有局限我司合成視頻,各引物編碼序列見表 1。 RT-qPCR 體現 裝修標準 25 μl: SYBR 熒 光 染 料 12. 5 μl, 上 游 引 物(100 μmol / L)1 μl,在下游引物(100 μmol / L) 1 μl, cDNA 0. 5 μl,DEPC 水 10 μl。 在 ABI 7500 時時熒 光定量分析 PCR 儀安于現狀行增加反響,響應具體條件:預性質發生變化95℃ 1 min;增加降鈣素原檢測步驟 40 個重復,反復數據:變 性 94℃ 15 s,退火工藝 50℃ 15 s,延申 72℃ 45 s;充分均勻溶解曲 線 60 ~ 95℃ , 加水時延 0. 1℃ / s, 助手基因遺傳為 βactin,實驗性按順序 3 次。 按量進行分析城市熱力圖熒光按量 PCR 依次測得需求表觀遺傳 Dectin-1、NLRP3、caspase-1 及內 參 β-actin 的 Ct 值,實驗室結果取其差不多值,用 2 -ΔΔCt來提出基因組展現量變化。

3.2.5  Western blot 檢 測 Dectin-1、 Syk、 NLRP3、 ASC、pro-caspase-1、caspase-1 球蛋白表示 取 6 孔板 內部放在冰里,每孔加 200 μl 含 PMSF 的 RIPA 裂 解液,用凈的刮刀將細胞刮于 EP 管內,冰里裂解30 min,于 4℃ 下 12 000 r/ min 離心式 15 min,時候加 淀粉酶上樣抗震液,熱開水煮 5 min,放置冷卻后,電泳 80 V, 30 min;120 V,55 min,轉膜 120 V,1 h 30 min,制冷 封閉型 2 h,4℃隔夜孵一抗,二抗溫度孵育 2 h,洗膜,暴光三維成像,在 Image J 平臺分折獲得蛋白質 IOD 值,并依據目的意義核蛋白 IOD/ 內參蛋清 IOD,折算基本原則血清 相比較灰度值,實行核算介紹。

3.2.6 ELISA 法檢測工具巨噬生殖細胞提升液中 IL-1β 和 IL-18 的水平 結合免疫試劑盒闡明書必須,將腫瘤細胞懸液 于3 000 r/ min 離心力10 min 快速清理顆粒物和匯聚物;安裝 規范標準品孔,樣本量孔,條件品孔引入有所差異鹽濃度條件品 50 μl,待測檢樣孔里先入駐待測檢樣 10 μl 加個樣 品稀釋溶解液 40 μl;馬上又每孔參加 HRP 標識的檢測工具抗 體 100 μl,封板,37℃溫育 60 min;棄固態,不停洗滌 5 次,拍干;每孔參與底物 A、B 各 50 μl,37℃陰涼溫 育 15 min;每孔融入停止液 50 μl,15 min 內 450 nm

04最主要導致

4.1 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖誘惑的 RAW264. 7 巨噬組織增值化學活化的損害

 長為 1,MTT 法細胞系增 殖活力性檢側報告呈現,與沒字差表組相較,β-1,3-D葡聚糖在 70 μg / ml 滲透壓夠分明抑止 RAW264. 7

巨噬神經細胞衍生,神經元存活期率

的降低 50% ,文化差異體現了統 計學真正意義(P<0. 001)與 β-1,3-D-葡聚糖誘導性模 型組相較于,丹皮酚在480μmol / L密度并能看不出提高RAW264. 7 上皮細胞增值朝氣,神經細胞維持率回升,不同之處具 有調查統計學現實意義(P<0. 001)。

圖 1 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖分析的 RAW264.7 巨噬細

胞繁衍活性酶的干擾(n=6)

4.2  丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖引誘的 RAW264. 7 巨噬體細胞結構學的影響到

如 2,在 400 倍反置顯 微鏡下觀察植物,空缺比對組細胞體積計算偏小,體現飽和圓 潤特性;β-1,3-D-葡聚糖介導建模組組織差異性為嚴重,

受損細胞重量擴增,要素多不方式,有“偽足”抬起,組織細胞 不太 狹 長, 有 的 甚 至 呈 梭 形; 丹 皮 酚 干 預 組 細 胞細胞分化明顯的改善,細胞膜密度變小,“偽足”情況看不出減少,組織大要素完全恢復至近半圓的情況。

     圖 2 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖誘騙的 RAW264.7 巨噬細 胞要素學的反應(n=6,×400)

4.3 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖引發的 RAW264. 7 巨噬受損細胞 Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、 caspase-1 蛋白質體現的直接影響

如下圖 3,與留白剖析組 對比, β-1,3-D-葡聚糖誘導型3d模型組 Dectin-1、 Syk、 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 核蛋白呈現量明 顯偏高,對比兼具匯總學的意義(均P <0.05 )與 β1,3-D-葡 聚 糖 誘 導 模 型 組 相 比, 丹 皮 酚 干 預 組Dectin-1、 Syk、NLRP3、ASC、 pro-caspase-1、 caspase-1 蛋白酶表述量顯著縮減,差異性具有著計算學意義所在(均 P< 0. 05)。

圖 3 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖幫助的 RAW264． 7 巨噬細 胞 Dectin-1、 Syk、 NLRP3、 ASC、 pro-caspase-1、 caspase-1 淀粉酶形容的損害(n=3)&nbsp;

4.4  丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖成脂的 RAW264. 7 巨噬體細胞 Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA 表達方法的的影響

圖甲 4,與空白頁比組相比之下,β-1,3-D-葡聚糖 誘導性模特組 Dectin-1、NRP3、caspase-1 mRNA 表達方法量 顯眼增大,不同之處含有統計分析學重大意義(均P <0.05 )與

β-1,3-D-葡聚糖分析模板組相對,丹皮酚認知組

Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA 表現量清晰降底,

地域差異更具數據匯總學效果((均P <0.05 )

圖 4 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖誘導性的 RAW264． 7 巨噬細胞膜

Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA 傳達的損害(n=3)

4.5  丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖誘導型的 RAW264. 7 巨噬癌細胞排出 IL-1β、IL-18 的印象

如下圖所示 5,與空缺 較組相比之下,β-1,3-D-葡聚糖幫助三維模型組受損細胞分泌出 的 IL-1β、IL-18 標準清晰上升,差別兼備計算學有何意義

(P <0.01 )與 β-1,3-D-葡聚糖誘導性模式組相較,丹 皮酚調查組癌細胞的代謝的 IL-1β、IL-18 層次顯然大幅度降低, 不同之處具備測算學含義((均P <0.05 )

圖 5 丹皮酚對 β-1,3-D-葡聚糖引誘的 RAW264.7

巨噬體細胞產生的 IL-1β、IL-18 的應響(n=3)

05談話

β-1,3-葡聚糖是白色念珠菌組織細胞壁的大部分物質,并在真菌感染神經太過緊繃增值能力或生亡時從腫瘤細胞壁掉發,使用與巨噬腫瘤細胞外壁感覺聯系介導真菌感染因素存在[18-20] 。 巨噬內部則是 通 過 模 式 識 別 受 體 ( pattern recognition receptors,PRRs)來判斷 β-1,3-葡聚糖,并的分泌慢性炎癥 要素以提高支原體感染癥狀發生的[21] 。 PRRs 分腫瘤細胞外和 血細胞質內,膜外以 Dectin 大家族蛋白激酶科學研究較多,膜內 則以 NOD 樣感覺(NOD-like receptor,NLR) 深受關 注[22] 。 各舉 C 型 凝 集 素 結 構 域 家 族 7 成 員 A (CLEC7A;也稱之為 Dectin-1)是 C 型凝集素感覺宗族 的 PRRs, 正常識別細菌細胞表面顯示的 β-1, 3-葡聚 糖[23,24] 。 NLRP3 也叫 NOD 樣多巴胺受體核蛋白 3,隸屬于炎性 塑料體的感應器血清[25] 。 當生殖細胞受染病激刺時,被 激活卡的 NLRP3 出現 NLRP3 炎性小體,在炎性小體 的用下,增強上下游炎性神經細胞系數 IL-1β 和 IL-18 的 脫離得以受到真菌感染作用[26-28] 。

新近研究分析得出結論,胃腸念珠菌轉變與 ALD 存有廣泛 關聯關系,長年純酒精促使后,腸腔念珠菌菌群失調,病菌過 度出現,β-葡聚糖當做好多共生關系念珠菌細胞系壁的主耍 材質,實現腸深層,經門冠狀動脈轉運公司到腎臟,與肝巨噬 癌細胞上的感覺 Dectin-1 依照,激發 NLRP3 細菌感染小 體, 釋 放 IL-1β 和 IL-18 誘 發 小 鼠 ALD 炎 癥 挫裂傷[5,29] 。

在一開始身體內科學試驗中,人們在 Lieber-DeCarli 酒 精液祠料伺養 C57BL / 6 小鼠保持 ALD 模板,出現 酒精濃度伺養導致胃腸真菌感染失調癥,白色念珠菌豐度添加,血清 中 β-1, 3-D-葡 聚 糖 水 平 升 高, 肝 臟 中 Dectin-1 / NLRP3 手機信號信號通路上關于球蛋白形容量更多,遭受 ALD 炎癥病變發生反應。丹皮酚介入后,腸胃真菌孢子失常得到了提升,血清中 β-1,3-D-葡聚糖層次調低,胰腺中 Dectin-1 / NLRP3 數據信號信號通路上涉及到血清表述量可以減少,ALD 細菌感染 的反應能夠 減輕。 公司推測丹皮酚抗 ALD 感染破損 將會與減弱 β-1,3-D-葡聚糖介導的 Dectin-1 / NLRP3 信息徑路的存在涉及到性。

為安全驗證丹皮酚是否有實現中醫 Dectin-1 / NLRP3 信號燈徑路來預放由 β-1,3-D-葡聚糖進而引發的 ALD 炎 癥破損,大家應用軟件 β-1,3-D-葡聚糖誘惑 RAW264. 7巨噬癌細胞實現身體 ALD 真菌感染問題三維模型,在 β-1,3-D葡聚糖引發 RAW264. 7 巨噬人體細胞 24 h 后,探究丹皮 酚在造模前調控下到底能不能對 β-1,3-D-葡聚糖致炎能起 防護呵護的功效,并檢查 Dectin-1 / NLRP3 4g信號徑路相 關血清有沒進行發生變化。 大家還適用了 Dectin-1 阻擋 劑昆布多糖來查證 β-1,3-D-葡聚糖激勵的效果。 實驗 科研表示,能夠 MTT 法查測組織細胞繁殖親水性與反過來顯 微鏡基本特征學觀察植物發掘 β-1,3-D-葡聚糖成脂下的 RAW264. 7 巨噬人體細胞發現宮頸炎癥直接損傷,內部增值能力充滿活力 削弱,受損細胞維持率下降,而丹皮酚應對后能有效率化解 并調理 RAW264. 7 巨噬細胞膜的發炎損壞,加快組織 繁殖力量。 想要蠟燭燃燒實驗丹皮酚抗感染癥板材損害的意義機 制,并原則之前的內實驗,你們從 β-1,3-D-葡聚糖 融入腎上腺素受體 Dectin-1 為選擇突破口,轉而涉及面 Dectin-1 / NLRP3 有關信息徑路。 經實驗室靈魂存在,β-1,3-D-葡聚 糖誘 導 24 h 后 的 RAW264. 7 巨 噬 細 胞 中 存 在 Dectin-1 / NLRP3 的信號環路啟用,相對于亂碼照表 組,β-1,3-D-葡聚糖引誘建模方法組 Dectin-1 / NLRP3 信 號徑路相關的淀粉酶成脂 Dectin-1、 Syk、NLRP3、ASC、 pro-caspase-1、caspase-1 或是感染細胞 IL-1β、IL-18 都清晰偏高。 而丹皮酚應對 24 h 后可更為明顯減少 β1, 3-D-葡 聚 糖 誘 導 的 RAW264. 7 巨 噬 細 胞 中 Dectin-1、 Syk、NLRP3、ASC、 pro-caspase-1、 caspase-1 蛋清表示能力和 Dectin-1、NLRP3、Caspase-1 mRNA形容技術水平,或者細胞核排泌的 IL-1β、IL-18 技術。 顯示 丹皮酚能強勢防控 β-1,3-D-葡聚糖誘發可致的 RAW264. 7 巨噬體細胞炎癥病變反響,而使舒緩和調節細 胞繁殖行動力變弱與生殖細胞損壞, 預測出應該與抑制 Dectin-1 / NLRP3 走勢信號通路的繳活有觀,超過實驗室結 果與開始的時候身體內實驗設計畢竟一致性。 進行體里、身體外實驗室 驗證通過,我們大家行推定丹皮酚是用控制 β-1,3-D-葡 聚糖,恰恰能阻隔 Dectin-1 與之緊密聯系,因此遏制 NLRP3 炎 癥小體激活碼,才能使巨噬內部外分泌 IL-1β、IL-18 水準 降低,避免 ALD 炎癥病變問題。 與 Xiao 等[30] 宣傳報道的腸 道真菌菌群失衡形成 LPS 與 TLR4 結合在一起,并修改密碼核 指數公式 NF-κB 分析的 ALD 宮頸炎癥問題比起,我們大家的探討 是特征提取腸子真菌孢子菌群舉例說明分解終產物 β-1,3-D-葡聚糖 在 ALD 中的偏態幫助,以至于,改進直腸細菌菌群,抑 制 β-1,3-D-葡聚糖就已成了改善 ALD 的比較重要的治 療靶點和不確定性技術手段。

總而言之,丹皮酚幾率按照減弱 β-1,3-D-葡聚糖誘 導的巨噬細胞膜 Dectin-1 / NLRP3 信息環路上 Dectin1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 的表明 進而合理消減終末感染成分 IL-1β、IL-18 的放, 以求有效率緩和 ALD 感染反映。 自己的工作數劇進 一步驟校驗了丹皮酚能夠防范 ALD 炎癥病變斷裂,深入調查探 討了丹皮酚對胃腸真菌感染細胞代謝有機物 β-1,3-葡聚糖相關內容 的 Dectin-1 / NLRP3 信號燈環路要點淀粉酶的監測意義, 為將其規劃設計成當下的抗 ALD 藥劑作為新的探究思 路和根本的科學實驗標準。