【Hortic Res】miR390b的過表達可促進楊樹莖的伸長和高度生長

【Hortic Res】miR390b的過把你想表達出來可有助于楊樹莖的拉伸應變和高發展

一 文章標題資料

提題：Overexpression of miR390b promotes stem elongation and height growth in Populus

刊名：Horticulture Research

小說作家：Xueping Shi，Qiaofang Shi et al.

行業：Huazhong Agricultural University

年月日：21 November 2022

二 緒論

MicroRNA390 (miR390) 采用調低中上游表觀遺傳反式反應短要素 RNA3 ( TAS3 ) 和AUXIN RESPONSE FACTORs ( ARFs ) 的表達愛參入值物生長的成長發展。miR390-TAS3-ARFs環路參入楊樹莖成長發展的研究探討較少。

來到里，憑借小 RNA 測序淺析建立了楊樹莖生長時候中地域差異展示的 miRNA，并證明了 miR390b 在莖生長中的新作用。miR390b (OE-miR390b) 的過展示形成實木紋部纖維材料腫瘤人體細胞量的很多增強和縱軸處腫瘤人體細胞時長的中度減輕。在 OE-miR390b 沉水作物中留意到莖生長和沉水作物非常的總體設計增強。

可根據轉錄組測序結論和瞬時共傳達數據分析，TAS3.1和TAS3.2被司法鑒定為楊樹miR390的靶基因遺傳，并在頂尖受miR390負監測。ARF3.2和ARF4的轉錄水平面在 OE-miR390b 樹種中接受顯著抑制作用，因此與沿縱軸的木制品部食物纖維體細胞用量呈猛烈負有關的信息。一些遇到顯示，楊樹中盲瘺的 miR390 - TAS3 - ARFs徑路與莖拉伸應變和株高成長有關的信息。

三 重點沒想到

3.1 干腫瘤細胞胸部發育時候中miRNA的簽別和表達方法譜

為了更好地科研莖發育期的初中級和次級發育時候中差別的表明的miRNA，跟據毛白楊15中的轉錄成分析結杲，進行9年的三角型型楊I-69×I-63（一些成為三角型型楊）的端點（AP）、節間（IN）2-IN5和IN9算作sRNA Seq的樣表（圖1A和添加圖1）。嫩葉（LF）算作比。從24個sRNA文比對庫大概才能得到9207679至13121893個clean reads（添加表2）。

依據miRNA展現值的主的成分深入分析（PCA）（補點資料集1）證實，AP、IN9和LF從IN2-IN5樣件中顯眼分離處理（圖1B）。樣表相當中擁有75-7個miRNA對比分析展現（補點資料集2）。用食用k平均值聚類分析法算法將所有生態學操作中的miRNA展現經濟經營模式聚類分析法算法為7組，換取了二個生態學操作中兼有保持一致展現經濟經營模式的40個對比分析展現miRNA（圖1C）。在對比分析展現的miRNA中，有四大（涉及miR159c、miR171a-5p、miR171e/f/g-3p/h-3p/i和miR390a-c/d-5p）、十二種（涉及iR160b-3p/c-3p、miR172h-5p、iR172d-e、miR172g-3p/h3p、miR168a-3p/b-3p和miR6427-3p）和這七種miRNA（涉及miR164a-e、miR2111a/b、miR390d-3p、iR394a-5p/b-5p、micro396a/b、micro396c/d/e-5p和miR3967-3p）f）在AP中髙度展現，從初中級萌發到次級萌發的轉化（IN2-IN5）和IN9。那些miRNA在調節器干神經元生長發育中兼有暗藏的非常重要做用。

miR390a-c/d-5p在AP中兼有高形容平行，并舉行了進一大步學習。在楊樹DNA遺傳組中，十二個MIR390DNA遺傳（MIR390a-d）生產了四個MIR390成孰編碼隊列（MIR390a-c、miR390d-5p和miR390d-3p）。在此類編碼隊列中，miR390a-c和miR390d-5p的成孰編碼隊列是同一的。

發生變化對AP中高表明miRNA的注重，成長miR390a-c/d-5p的表明經濟模式能夠RT-qPCR印證，其在AP樣板中也展示出高表明（圖1D）

圖1三角楊I-69×I-63莖發育過程中小RNA測序和差異表達miRNA的樣品。（A） sRNA序列的AP、LF、IN2、IN3、IN4、IN5和IN9采樣。采集長度為2mm的節間樣本。比例尺為2cm。（B）AP、IN2-IN5、IN9和LF樣本中miRNA的PCA。（C）17種在干發育過程中差異表達的miRNA和23種在LF中高表達的miRRNA的熱圖。樣品名稱中的T1至T3表示樣品的三個生物復制。使用R中的pheatmap包以比例TPM繪制表達量。（D）通過RT-qPCR在不同樣品中積累成熟miR390a-c和miR390d。

3.2 miR390b在楊樹中普及發生

miR390氏族有來于163種植牙物的374個全體班子成員34，這里面306個全體班子成員共用同的成孰編碼回文回文序列（5'-AAGCUCGAGGAUAGCGCC-3'，用于miR390的規范標準成孰編碼回文回文序列），如編碼回文回文序列符號如下圖所示（圖2A）。

在等等回文隊列中，楊樹中miR390a-c/d-5p的成熟穩重回文隊列與條件回文隊列不對。中級證書轉錄物的RT-qPCR界面顯示了4個MIR390表觀遺傳，在半圓楊中享有不同的的展示模型。Pri-miR390a/b/d在AP和IN9中特別展示，而Pri-miR390c在IN9中活性朋友展示（補充維生素圖2）。

本探討以miR390b為探討人。研究背景miR390b前體隊列，借助5'RACE和3'RACE有miR390b初級職稱轉錄物的總長。MIR390b的總長轉錄物和一定的DNA隊列均為584bp，說明半圓肌的MIR390b中就沒有所含子（添加圖3）。轉錄初始位點座落在熟透miR390b上下游89 bp，miR390b座落在半圓豆人類基因組的0-6印染體（Chr06）上（圖2B）。無論怎樣miR390b的前體在與眾不同的楊樹類種中不太固執，但很多前體都導致了一致的熟透隊列（圖2C）。從與眾不同組建的tremula×P.alba INRA克隆7171-B4（左右稱呼717混種育種楊）中轉化成RNA并舉行高質量淺析（添加圖4）。717混種育種楊的初出根（PR）和葉柄（PT）中miR390b的形容方法標準較高，而幼莖（YS）和熟透葉（ML）中形容方法標準較低，針對是幼葉（YL）和AP（圖2D）。

方便進一步明確驟熟知 MIR390b的把你想傳達出來狀態，將由MIR390a起動子驅動包的GUS倡導體被轉化為野外型（WT）717雜交育種楊樹。GUS固色劑在6-8周齡組識培訓教育幼芽的AP和YL相應YS中查重到，也在ML的主心血管、LR的原基相應LR和PR的心血管組識中查重到（圖2E）。凡此種種，在主根尖（PRT）中查重到較弱的GUS固色劑，而在側根尖（LRT）中不存在固色劑（圖2E）。在6至8周齡的環境培訓教育常綠植物中，在第四葉柄（PT3）的皮下組織毛狀體和皮下組織神經人體細胞系相應初生木材部管內中查重到GUS固色劑（圖2F）。在PT9的皮下組織神經人體細胞系中也觀看到miR390b的把你想傳達出來，但在PT15中不存在觀看到（圖2F）。從IN3到IN9，miR390b在干的皮下組織神經人體細胞系中的把你想傳達出來慢慢的減掉，從而無非查重到（圖2F）。

由于莖次生出現的換季，miR390b的表達的方式出在初生木料部中頻頻擴大，雖然在IN15的髓X射線中也頻頻擴大（圖2F）。由于楊樹的出現，組織結構中miR390b的表達的方式出以頻頻的的方式連續變幻，產生了此時空非特異聊天

圖2 miR390b的序列保護和表達模式。（A） 來自163種陸地植物的miR390成熟序列的保護。序列標志中每個位置的大寫字母的高度表示保護程度。（B） MIR390b基因在楊樹基因組中的定位。藍色框表示MIR390b基因的全長，橙色框表示MIR390b前體，紅色框表示成熟的MIR390b。（C） 不同楊樹品種中miR390b前體的序列比對。紅色框表示成熟miR390b的序列。（D） 通過RT-qPCR檢測miR390b在WT不同器官中的表達水平。LR，側根；PR，主根；OS，舊莖；YS，幼莖；PT，葉柄；ML，成熟葉；YL，幼葉；AP，頂點。（E和F）含有由MIR390b啟動子驅動的GUS報告基因的轉基因楊樹的組織化學染色。6至8周齡的組織培養幼苗（E）和6至8周齡的土壤培養幼苗（F）用于GUS染色。LRT，側根尖；PRT，主要根尖。

3.3 miR390b的過度的表達出來提高網站楊樹莖長度

為了能確實miR390會不通過楊樹的AP健康，再用描述（OE）miR390b的媒體轉換WT 717改良品種楊樹通過表型觀察動物和鑒定費（補充圖5A）。在才能得到的9個獨有OE-miR390b系中，miR390b的描述層次在茶葉中上浮（補充圖5B和C）。

這之中，選購了前體揉成熟miR390b表達方式技術水平同質性調漲的這幾個OE-miR390b系（即OE-42、OE-44和OE-65）代替后繼實踐（圖3A和攝入圖5D）。將WT和OE-miR390b系移入溫室苔蘚草木的植物生長后，表述OE-miR290b系少于WT苔蘚草木（圖3B）。每天在比較固定日期估測苔蘚草木的苔蘚草木的植物生長數據統計，效果表述OE-miR390b系從連接點到連接點10的大小比WT深為30%（圖3C）。縱然與野生穿山甲型相對于，OE-miR390b株系每個月的的超高上升和節數增減無同步的同質性對比（攝入圖6A和B），但超高與節數的月上升率同質性提高（圖3D）。

與此同時，OE-miR390b株系中株高與組件數之比的不同之處性擴大是由株高的不同之處性擴大并非全部莖葉總組件數的擴大致使的（補圖6C-E）。關鍵認為，從IN5到IN10的OE-miR390b株系的每個IN大小都不同之處性短于WT（圖3E和F），尖部外徑和IN外徑還并沒有不同之處性不同之處（補圖6F和G）。OE-miR390b品系和WT相互的葉特征、葉面積和葉長寬比還并沒有不同之處性不同之處（補圖7A-C）。

凡此種種，在根行態、根干重和根鮮重問題沒了洞察分析到相關性不同（補點圖7D-F）。楊樹的IN寬度由多個問題絕對：人體公司神經生殖上皮細胞總數和沿樹桿縱軸的人體公司神經生殖上皮細胞寬度。因為作出問題，在橫斷面中洞察分析到土壤中訓練苔蘚植物中維管公司的骨骼發育管理狀況期，并在縱斷面中校正木箱部釬維人體公司神經生殖上皮細胞（早已經歷人體公司神經生殖上皮細胞壁變厚）的寬度（圖3G和H）。OE-miR390b系中IN4的心血液骨骼發育管理狀況期感覺與WT中IN6的心血液骨骼發育管理狀況期管理狀況大致相擬，擁有OE-miR290b系和WT的IN7中間引發了木箱部釬維人體公司神經生殖上皮細胞的分次衍生（圖3G）。

IN8的出口部彈性棉仟維組織神經上皮體細胞厚度的衡量和統計匯總定性分析取決于，OE-miR390b系中的出口部組織神經上皮體細胞厚度比WT短7-10%（圖3H和I）。雖然，OE-miR390b系中IN8出口部彈性棉仟維組織神經上皮體細胞在縱軸上的相應數比WT高37-47%（圖3J）。許多報告取決于，miR390的過表達出加快了莖的受力和植物體的相對高度，并添加了出口部彈性棉仟維組織神經上皮體細胞在縱軸上的數。

圖3 miR390b的過快抒發出來催進了楊樹的莖拉伸應變。（A） 成熟穩定miR390b在4周齡組建養育的WT秧苗和過抒發出來miR390b的系（OE-miR390b）的葉面中的抒發出來能力。PtActin算作內源性把握基因遺傳。（B） WT和OE-miR390b系的狀態學表型。與野山型比起來，OE-miR390b系在溫室中呈現出較高的株高。（C和D）WT和OE-miR390b線從端點到構件10的粗度和從非常到構件數的月增速的統計匯總數了解。（E） WT和三大OE-miR390b系從端點到構件10的狀態學查看。淺茶色實線說構件的職位，淺茶色虛線聯系的構件是WT和OE-miR390b線期間的對照構件。分配比例尺為1 cm。（F）WT的節間粗度和（E）中IN3至IN10的這三條OE-miR390b線。（G） 用0.05%甲苯胺藍上色的血官組建的組建學了解。橫載面來自WT和OE-42的IN3至IN7。Ca、演變成層；韌皮部；Xy，鐵質部；（H） WT和OE-miR390b系IN8縱切面的組建學上色。淺茶色虛線說鐵質部棉玻纖組織的兩端。（I和J）是中IN8棉玻纖組織粗度的統計匯總數了解。

3.4 在全人類DNA組領域內親子鑒定對最頂聚集中miR390過表達方式反饋的人類DNA

苔蘚植物SAM(芽最上層分生結構)使用側的器官的常規形成絕對了莖節間橫向上的腫瘤細胞需求量，這最后影響力了ins（節間）的長寬高。關鍵在于不斷探索miR390介導的干張拉的中游方法，相當了兩個OE-miR390b系和WT的AP(最上層)結構的轉錄組數據分析。

評均衡量，所有模板的75%這的clean reads與P.trichocarpa的對比染色體組特情人對比分析（補表3）。PCA的然而表面，6個OE-miR390b系與WT很明顯分離法（補圖8）。

完成相對OE-miR390b系和WT區間內的人類什么是遺傳什么是基因表現方式含量（補給維生素資料集3），OE-42、OE-44和OE-65中分發型別有173、303和66個不同表現方式人類什么是遺傳什么是基因（DEG），這里面47、76和16個人類什么是遺傳什么是基因表現方式上漲，126、227和50個人類什么是遺傳什么是基因表現方式上漲（補給維生素資料低效4，圖4A），反映出每次OE-miR390b系亞冠過70%的DEG沒有響應miR390b的過分表現方式而表現方式上漲。

Venn圖出現，在3條OE-miR390b線黨中央監定出3815個DEG，但二者的有2七個DEG（圖4B和填補表4）。熱圖出現，在3條OE-miR390b線中，五個DEG調整，23個DEG調整（圖4C）。以下畢竟證實，miR390b在楊樹中的適度傳達會不良影響關聯基因組的傳達層次，并重要更好地發揮負宏觀調控功能。

圖4楊樹上端組建中對miR390b過抒發方式現象的遺傳基因遺傳的監定（A） OE-miR390b系和WT兩者之中上漲和調低區別抒發方式遺傳基因遺傳（DEG）的規模。（B）八個OE-miR290b系兩者之中的重復DEG。（C） 八個OE-miR390b系一共抒發方式DEG的聚類分析。

3.5 TAS3.1和TAS3.2是楊樹miR390的靶DNA

身為種內源性非編寫代碼小RNA，miRNA大部分能夠 切工河流下游靶表觀遺傳的mRNA來調觀賞植物種子發芽和胸部發育。但是，miR390靶表觀遺傳的鑒定費對待研究其調莖拉伸應變的效果具備有必要積極意義。

四位TAS3遺傳遺傳基因組，即TAS3.1（Potri.010G149600）、TAS3.2（Potri.008G101675）、TAS3.3（座落Chr18上）和TAS3.4（Potri0.002G191950），被鑒定費為楊樹中miR390的備選靶點。在經驗遺傳遺傳基因組中，TAS3.2是屬于5個OE-miR390b系許昌的DEG的一種（圖4C）。備選靶遺傳遺傳基因組TAS3.1和TAS3.2髙度同源，具備著髙度一樣的隊列架構（圖5A）。與以后的報表保持一致，楊樹中第21個大概核苷酸的G:U扭動堿基對和第2多個核苷酸在5'靶位點（TS）的錯配，及其3'TS處的四位核苷酸的錯配（圖5A）。

為效驗miR390是不是也行單獨裁切四個隱性靶人類基因的3'近端TS，實用了鹽業葉輪中的瞬時共形容（圖5B-J）。與四個呈呈陰性對照組相對來說，與OE-miR390b+TAS3.1/TAS3.2-3'TS-GFP（即b+d/e）共肌注的綠色的熒光蛋清（GFP）熒光標準顯著性減低（圖5C、e、G和i）。同時，與負載體+TAS3.1/TAS3.2-3’TS-GFP（即a+d/e）共肌注的GFP熒光標準也明星不超另一四個呈呈陰性對照。在鹽業中，miR390家庭有四個全體成員（miR390a-c），進來miR390b和miR390c的熟編碼隊列與楊樹miR390a-c和miR390d-5p的編碼隊列一樣，熟miR390a與楊樹miR390的區別僅而言3'近中端同一個堿基區別（及時補充圖9）。

因而，判定假設檢驗鹽業行業miR390可以打磨攜帶不確定靶DNA3'近端TS的各種載體。因而，與STTM（短結合虛擬仿真）-miR390+TAS3.1/TAS3.2-3'TS-GFP（即c+d/e）共注謝的鹽業行業茶葉的GFP熒光力度有明顯少于OE-miR390b+TAS3.1/TAS3.2-3'TS-GFP和空各種載體+TAS3.1/TAS3.2-1'TS-GFP（圖5D，F，H和J）。報告單證明TAS3.1和TAS3.2是楊樹miR390的靶DNA。

圖5 miR390在人體內會裁割TAS3.1和TAS3.2的驗正（A） 靶什么是dnaTAS3.1和TAS3.2的字段解析一下。淺黃色字段寫出與miR390互補式的靶位點（TS）；黃綠色下劃線字段警示tasiaARF1；黃綠色下劃線字段警示tasiaR2；橘淺黃色下劃線字段寫出tasiaF3。（B） 鹽業瞬時共表現中的使用的膜球蛋清的結構的提醒圖。a、 空膜球蛋清；b、 OE-miR390b膜球蛋清；c、 STTM-miR390膜球蛋清；d、 TAS3.1-3’TS-GFP膜球蛋清，其過表現挾帶TAS3.1什么是dna3’近端靶位點的GFP溶合球蛋清；e、 TAS3.2-3’TS-GFP膜球蛋清，其過表現在TAS3.2什么是dna3’近端挾帶TS的GFP溶合球蛋清；f、 挾帶TAS3什么是dna的1兩個核酸變動位點的GFP溶合球蛋清的過表現膜球蛋清；pri-miR390b，miR390b的初中級轉錄物；STTM，短并聯靶仿真；tas3什么是dna的變動體tas3。（C-F）將帶有不同于膜球蛋清組合名字構成的根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）共填充到鹽業（Nicotiana benthamiana）葉輪葉片的背后表層下。b+d和b+e為調查組，別的組合名字構成為呈陰性對比。淺黃色虛線寫出共裝入區域性。（G和H）圖C和D中GFP熒光標準的一定量解析一下。（I和J）圖E和F中GFP的熒光標準的評定解析一下。

在WT中，TAS3.1的理解平行在PR和AP中有明顯更低，但在YS和ML中更多（圖6A）。除YS和AP外，另一類個靶基因遺傳TAS3.2在相關楊樹組織性中的理解平行較低（圖6B）。

miR390b的展示在OE-miR390b系的有差異 進行中有效調漲，還是比較是在ML、YL和AP中，其比WT高100倍左右（圖6C）。對方什么是基因TAS3.1和TAS3.2在OE-miR390b系中癥狀出有差異 的水平的變動展示（圖6D和E）。TAS3.1在三大OE-miR390b系的LR、YS和YL中有效變動，在單一OE-miR319b系的PR、舊莖（OS）、ML和AP中有效變動（圖6D）。

拿來OE-42和OE-65在PR中的表面沒表面出不一的正相關區別外，TAS3.2在三大OE-miR390b系的那些另一個機構中正相關上漲，在AP中更上漲（圖6E）。一些沒想到說明，miR390b的過表面合理有效地壓制了靶遺傳基因TAS3.1和TAS3.2在楊樹中的表面標準，而對TAS3.2的壓自制用在YS和AP中更正相關。

圖6 什么是基因組遺傳遺傳的轉錄總體總體標準和ARF表示總體總體標準與發生數劇之間的共表示介紹。（A和B）靶什么是基因組遺傳遺傳TAS3.1（A）和TAS3.2（B）在WT不一樣團隊中的表示策略。（C-E）這三個OE-miR390b系的不一樣團隊中miR390b（C）和靶什么是基因組遺傳遺傳（D和E）的表示總體總體標準。WT作為一個比較。LR，側根；PR，主根；OS，舊莖；YS，幼莖；PT，葉柄；ML，熟葉；YL，幼葉；AP，極點。（F-J）按照RNA-Seq和RT-qPCR介紹底部團隊中ARF的轉錄總體總體標準。（K）6個ARF什么是基因組遺傳遺傳與OE-miR390b系五種方法表型之間的關聯性介紹。這五種方法表型有IN長寬、人造植物纖維材料生殖神經細胞總量統計和人造植物纖維材料生殖神經細胞長寬。（L） 提供 的miR390/ARF3.2/ARF4可以可以可以調節楊樹莖伸展的繪圖。miR390吸附TAS3發生的tasiARFs對ARF3.2和ARF4的表示發生負可以可以可以調節，引致中上游STM的表示調漲。STM對側枝地方的開機起負可以可以可以調節效用，引致木頭部人造植物纖維材料生殖神經細胞總量統計加強，繼而引致莖伸展。

3.6 miR390-TAS3調節楊樹ARF（生長素卡死要素）的予測

為了能預測在楊樹莖長度的時候中怎樣ARF感受到miR390-TAS3的中上游國家宏觀調控，并借助權重有關系互聯網解析（WGCNA）對其進行OE-miR390b表型與全dna組dna展示總體水平相互間的有關系性解析。

在染色體組中，通用36個染色體被注解為ARF血清。這類血清質回文隊列的起點終點與基擬南芥的ARF2、ARF3和ARF4血清質回文隊列某個廣泛用于創設系統性健康成長樹（提供圖10）。Potri.012G106100和Potri.015G105300的血清質與擬南芥ARF2是歸算是同個旁支，意味著至高的形似性，都稱做ARF2.1和ARF2.2。互相，Potri.004G050150和Potri.011G059300的血清質與擬南芥ARF3是歸算是同個個旁支，Potri.0009G011800和擬南芥ARF4是歸算是同個旁支，都稱做ARF3.1、ARF3.2和ARF4。

即使Potri.011G059101也被預計為ARF3/434，但因與擬南芥ARF3/4的創新的關聯荒涼，對此在下某些理論研究中省略了它。在miR390b過理解出來的導致下，按照RT-qPCR查測楊樹中多種ARF的理解出來的質量方向。畢竟發現，ARF2.2、ARF3.2和ARF4的轉錄的質量方向在四個OE-miR390b系中被明顯減緩（圖6G、I和J）。即使ARF2.1和ARF3.1的理解出來的質量方向僅在獨立個體OE-miR390b系中被明顯減緩，但一些系中的理解出來的質量方向也反映下跌發展趨勢（圖6F和H）。

ARF人類基因組在RNA-Seq數據統計資料中的呈現上升趨勢與RT-qPCR的畢竟基本的不一（圖6F-J）。憑借有關的聯數值預測出產于RNA Seq的人類基因組呈現平均水平與OE-miR390b系的不同表型數據統計資料范圍內的共呈現相互關系，并挑選miR390有利于莖生長的上下游關健ARF。因其miR390對ARF的負調準做用，主要分析了與IN間距和人造纖維棉上皮人體細胞規模負有關的聯、與人造纖維棉上皮人體細胞間距正有關的聯的ARF，粉紅顏色傳感器中的ARF3.2和ARF4與上述所說七種表型最增進有關的聯（圖6K和補給圖11）。畢竟表述，ARF3.2和ARF4對miR390b的過度的呈現產生反映，并與miR390聯合參與的楊樹的莖生長。

四 論文

miR390b的過把你想表達出來能否利于717混種雜交楊樹的莖張拉和位置成長。企業的效果意味著，miR390b-TAS3.1/TAS3.2-ARF32/ARF4環路體驗轉換等菌物操作過程。miR390b-TAS3在轉換樹高成長中的體驗為miR390族氏在轉換草本花卉成長和胸部發育中提高了新的模塊，這對林木菌物工藝探析也具備有為重要意義上。

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